用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶、编码基因

 健康动态     |      2020-02-25

  用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶、编码基因、重组载体及应用的制作方法

  本发明涉及生物技术领域,尤其涉及用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶、编码基因、重组载体及应用。

  背景技术:

  β-烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide,NMN)是烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphate ribose transferase,Nampt)与烟酰胺等反应的产物,同时是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)补救合成途径的关键前体。

  在哺乳动物体内,NMN由烟酰胺(Nicotinamide,Nam)在Nampt的催化下生成,随后NMN在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nicotinamide mononucleotide adenosine transferase,Nmnat)的催化下生成NAD+。即,NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能,如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶,又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。

  近期研究发现,通过调节生物体内NMN的水平,对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用;另外,NMN还可通过参与和调节机体的内分泌,起到保护和修复胰岛功能,增加胰岛素的分泌,防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。因此,NMN在医药治疗以及功能食品方面有着广泛的应用前景。

  但是,NMN的体外制备方法,以化学合成为主,比如,2002年,Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在TMSOTf的催化下发生缩合反应;又比如2004年Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化,然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应;这些化学合成方法存在成本高、收率低而且化学试剂污染大等问题。

  目前制备NMN的最环保最好的方法是生物合成方法,即采用Nampt催化Nam生成NMN;且一般是利用酵母来实现合成NAD前体NMN;现有的天然Nampt存在酶活性较低的问题,存在耗时长、成本高、收率低,难以实现工厂化大规模生产等问题,限制了NMN的大规模应用。

  技术实现要素:

  本发明的目的之一,就在于提供一种烟酰胺磷酸核糖转移酶,以解决上述问题。

  为了实现上述目的,本发明采用的技术方案是这样的:一种用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶,所述酶为如下(a)或(b)或(c)的蛋白质:

  (a)其氨基酸序列如pSEQ ID No.1所示的蛋白质;

  (b)其氨基酸序列如pSEQ ID No.3所示的蛋白质;

  (c)在(a)或(b)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸并具有催化烟酰胺得到β-烟酰胺单核苷酸活性的蛋白质衍生物。

  作为优选的技术方案:所述(c)的蛋白质具有如pSEQ ID No.2或pSEQ IDNo.4的氨基酸序列。即pSEQ ID No.2是在pSEQ ID No.1的基础上优化而来;pSEQ ID No.4是在pSEQ ID No.3的基础上优化而来。

  本发明的目的之二,在于提供一种编码前述的具有pSEQ ID No.1、pSEQ ID No.2、pSEQ ID No.3和pSEQ ID No.4所示的蛋白质烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因。即所有能够编码上述蛋白的基因均在本发明的保护范围内。

  作为优选的技术方案,编码ID No.1所示的蛋白质的基因的其核苷酸序列如nSEQ ID No.l所示;编码ID No.2所示的蛋白质的基因的其核苷酸序列如nSEQ ID No.2所示;编码ID No.3所示的蛋白质的基因的其核苷酸序列如nSEQ ID No.3所示;编码ID No.4所示的蛋白质的基因的其核苷酸序列如nSEQ ID No.4所示;这些优选的核苷酸序列具有大肠杆菌偏好,即更适合在大肠杆菌中表达。

  本发明的目的之三,在于提供一种重组表达载体,采用的技术方案为,所述重组表达载体含有上述的任一种编码用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因。

  本发明的目的之四,在于提供一种遗传工程化的宿主细胞,采用的技术方案为,所述宿主细胞包含上述的重组表达载体。

  作为优选的技术方案,所述宿主细胞为大肠杆菌。

  作为进一步优选的技术方案,所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)、BLR(DE3)、BL21(DE3)pLysS或M15、TB1或DH5α、Top10。

  本发明的目的之五,在于提供一种编码烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因的应用,采用的技术方案为,将其用于异源重组表达。

  作为优选的技术方案,所述于异源重组表达的方法为:

  包括以下步骤:(1)构建如权利要求5所述的重组表达载体;(2)利用步骤(1)所述重组表达载体转化宿主细胞,获得如权利要求6所述的遗传工程化的宿主细胞;(3)培养步骤(2)中的遗传工程化的宿主细胞,通过添加乳糖或异丙基硫代半乳糖IPTG诱导重组烟酰胺磷酸核糖转移酶的表达。

  本发明的目的之六,提供一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法,采用的技术方案为,包括以下步骤:(1)在权利要求10所述的重组表达中,添加底物烟酰胺;(2)在步骤(1)完成后,继续培养菌液,利用摇瓶法培养或发酵罐培养;同时每小时检测菌液OD600值,计算大肠杆菌密度;在OD600=3.0以下培养。

  作为优选的技术方案,采用大肠杆菌培养基培养,所述的大肠杆菌培养基为LB或PYA,培养温度为35℃-38℃。

  本发明的方法理论是利用NAD主要两条合成途径,即色氨酸从头合成途径和补救途径中的补救途径来实现的,产物为β-烟酰胺单核苷酸(NMN);本发明利用大肠杆菌发酵来实现,与以前利用酵母比较,本发明流程相对简单,各种投入和成本大大降低。

  与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明制备β-烟酰胺单核苷酸NMN方便高效,发酵工艺简单、耗时短、成本低,产量高达51.75mg每g蛋白;并且,获得NMN的成本为0.25-1.0元/mg,相对于传统方法,成本可以降低90%,经济效益显著。

  附图说明

  图1为本发明实施例中四种pET-Nam载体表达Nampt酶蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果图;图1中“Control”为带pET空载体的对照;

  图2为本发明实施例中四种pMal-Nam载体表达Nampt酶蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果图;图2中“Control+空载体”为带pMal空载体的对照,“Control-”为未转入载体菌样;

  图3为本发明实施例中四种pQE-Nam载体表达Nampt酶蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果图;图3中“Control”为带pQE空载体的对照;

  图4为本发明实施例中Western检测四种序列表达Nampt酶蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果图;图4中“Haemophilus ducreyi nadV”为杜克嗜血杆菌nadV酶天然基因序列转化载体大肠杆菌的表达作对照;“Control”为纯化的Nampt酶作对照;

  图5为本发明的重组载体构建、筛选及培养发酵流程图。

  具体实施方式

  下面将结合附图对本发明作进一步说明。

  1.材料与试剂

  1.1菌株及质粒载体

  菌株:大肠杆菌菌株DH5α、Top10、M15、BL21、TB1,市购。

  质粒载体:载体pET-28(a)、pMal和pQE-30,市购。

  1.2.试剂、试剂盒、酶

  试剂、试剂盒:磷酸酶标记山羊抗兔IgG(H+L)和NBT/BCIP染色试剂盒。荧光素酶检测系统(Luciferase Assay System)购自promega公司。其余试剂均为分析纯。

  酶:限制性内切酶BamHI,HindIII,T4DNA连接酶,rTaq酶和pFu酶。

  1.3培养基

  LB液体培养基(1L):胰蛋白胨10g,酵母抽提物5g,NaCl:10g,用5mol·L-1的NaOH调pH至7.0,高温灭菌。

  LB固体培养基(1L):LB液体培养基+琼脂粉15g。

  PYA培养基(1L):Na2HPO4 16.1g,KH2PO4 1.36g,NaCl 0.5g,酵母抽提物5.0g,CH3COONa 10.0g,用0.1mol/L NaOH或5%H2SO4.调节pH,根据pH数值在PYA名称后添加数值命名对应pH值的PYA培养基,如pH调至8,则命名为PYA8;高温灭菌。

  1.4主要试剂配方

  1.4.1DNA提取相关试剂:

  提取介质Ⅰ:Tris 0.2mol/L,EDTA-Na2 50mmol/L,NaCl 0.25mol/L,pH 8.0

  提取介质Ⅱ:Tris 0.1mol/L,EDTA-Na2 20mmol/L,NaCl 1.4mol/L,2%(m/V)CTAB,pH 8.0。

  1.4.2SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)相关试剂:

  30%丙烯酰胺贮存液:29%丙烯酰胺,1%双丙烯酰胺

  29g丙烯酰胺,lg双丙烯酰胺

  加蒸馏水至100ml,通风厨中搅拌至完全溶解后过滤,4℃贮存

  分离胶缓冲液:l.5M Tris-HCI(pH 8.8)。

  浓缩胶缓冲液:l.0M Tris-HCI(pH 6.8)。

  10%的过硫酸铵:

  1g过硫酸铵,加入蒸馏水定容至10mL。

  10%SDS:

  10g SDS,加入蒸馏水定容至100mL。

  10x电泳缓冲液(Tris-Gly电泳缓冲液):

  30g Tris,144g Gly,10g SDS;

  分别溶解于蒸馏水中,再定容到1000mL。

  2xSDS凝胶上样缓冲液(loading buffer):1M Tris-HCI(PH 6.8);0.2M DTT;4%(W/V)SDS;0.2%(W/V)溴酚蓝;20%(V/V)甘油。

  聚丙烯酰胺凝胶染色液:

  聚丙烯酰胺凝胶脱色液:

  分离胶:15mL

  浓缩胶:5mL

  1.4.3质粒提取相关试剂:

  溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0)。

  1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5mL,0.5M EDTA(pH 8.0)10mL,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500mL。高压灭菌15min,贮存于4℃。

  溶液Ⅱ:0.2N NaOH,1%SDS。

  2N NaOH 1mL,10%SDS 1mL,加ddH2O至10mL。使用前临时配置。

  溶液Ⅲ:醋酸钾(KAc)缓冲液,pH 4.8。

  5M KAc 300mL,冰醋酸57.5mL,加ddH2O至500mL。4℃保存备用。

  苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)。

  2.PCR扩增及其目的片段的回收:

  针对人工合成基因片段设计引物对分别加上BamHI和HindIII酶切位点,所述引物对的序列见表1;以合成的Nampt基因为模板进行PCR扩增,PCR条件如表2.1。反应参数:95℃预变性5min;然后30个循环(94℃30sec,58℃30sec,72℃1.5min);并于72℃继续延伸10min。反应在GeneAmp PCR System2400热循环仪上进行。将PCR产物末端加A:30μL PCR产物;30μL 10×PCR Buffer(不含MgCl2);2μL MgCl2;0.8μL pFU酶;1μL dATP,95℃:5min;72℃:30min;4℃保存。

  表1用于扩增Nampt基因的引物对列表

  *引物需添加酶切位点序列:5'-GCGGGATCC(BamHI);5'-GCGAAGCTT(HindIII)

  随后根据Tiangen公司的胶回收试剂盒说明书进行胶回收。

  表2 PCR扩增Nampt编码区的反应体系

  3.目的片段的双酶切

  将步骤2扩增得到的Nampt基因片段与提取的质粒pET-28(a)、pMal和pQE-30分别进行BamHI、HindIII双酶切。酶切体系如表3所示:

  表3双酶切检验体系

  1%琼脂糖电泳分离酶切片段后,用胶回收试剂盒回收相应片段,得到带酶切位点BamHⅠ和HindIII的目的片段。

  4.表达片断的连接、转化

  用T4DNA连接酶将步骤3所得的Nampt基因双酶切下的表达片断分别与以同样双酶切后的表达质粒pET-28(a)、pMal和pQE-30在16℃下连接过夜,构建重组表达载体pET-Nam、pMal-Nam和pQE-Nam。并将这两种重组表达载体分别转入大肠杆菌BL21(DE3)、TB1和M15感受态细胞,或转入DH5α、Top10感受态细胞筛选后作为保存重组载体的保存菌株。

  5.重组质粒的筛选

  挑取所得白色转化菌落作菌落PCR,扩增的反应体系和参数见Nampt基因片段的扩增,但模板改为菌落。

  把经菌落PCR检测,呈阳性的菌落在LB液体培养基上增殖培养,并提取质粒。方法采用现有的市售Sigma或Omega等质粒提取试剂盒。用BamHI和HindIII对重组质粒进行双酶切鉴定和测序检测。

  6.Nampt酶的诱导表达

  6.1诱导酶表达、取样

  吸取转化有重组质粒的BL21(DE3)、TB1和M15菌液各10μL,分别加入含有相应抗生素的LB液体培养基20mL,37℃和25℃条件下分别振荡培养至OD600值0.4-0.8,取出1mL培养物,收集菌体后至4℃保存,作为诱导前样品。向其余培养物中加入IPTG(终浓度为0.5mM),诱导4-8h后取样1mL,收集菌体后置4℃保存。

  6.2 Nampt酶样品处理

  取样完成后,如果制作细菌总蛋白,则向每次取样得到的菌体中加入100μL裂解buffer(50mM Tris-HCl(pH 8.5-9.0),2mM EDTA,100mM NaCl,0.5%Triton X-100,1mg/mL),再加入100μL 2×蛋白上样缓冲液。用移液器吹打均匀后,置沸水浴中煮10-15分钟,煮毕后12000rpm离心5分钟。上清即可上样。

  若需要将细菌总蛋白分为可溶和不可溶(包涵体)两部分分别进行检测,则向每次取样得到的菌体中加入100μL PBS,用移液器吹打均匀,冰浴条件下用水槽式超声破碎器对菌体的PBS重悬液进行超声破碎,直至溶液清亮,其间不断冷却以免破碎时积累的热量使释放出的蛋白变性而产生溶解性的变化。破碎完毕后,于4℃下13000rpm离心20分钟。然后小心转移上清至一新的离心管中。加入100μL 2×蛋白上样缓冲液,充分混匀,置沸水浴中煮10-15分钟,煮毕即制得可溶部分的蛋白样品。12000rpm离心5分钟,上清即可上样。对于沉淀部分,加入100μL裂解缓冲液和100μL 2×蛋白上样缓冲液,用移液器吹打均匀后,置沸水浴中煮10-15分钟,煮毕后即制得不可溶部分的蛋白样品,12000rpm离心5分钟后,上清即可上样。

  样品制备完毕后,进行12%的SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝R-250进行过夜染色。染色完毕后,用脱色液进行脱色。

  不同表达载体表达Nampt酶的SDS-PAGE电泳检测结果图见图1-3所示;从图1-3可以看出,本发明提供的4种烟酰胺磷酸核糖转移酶均能较好地在大肠杆菌中表达,为β-烟酰胺单核苷酸的生产提供了稳定的生物合成基础;同时优化的pSEQ ID No.2相对于pSEQ ID No.1有更好地表达,优化的pSEQ ID No.4相对于pSEQ ID No.3有更好地表达。

  7.表达产物的Western检测

  Western印迹分析参照现有方法进行。将SDS-PAGE凝胶上的蛋白电转移到硝酸纤维素膜上(100V稳压转移2h)。以小鼠中提取的Nampt酶抗血清作一抗,磷酸酶标记山羊抗兔IgG(H+L)为二抗,NBT/BCIP染色试剂盒进行Western检测。具体方法如下:

  转膜:硝酸纤维滤膜、胶、滤纸分别用转移缓冲液浸泡10-20min后将海绵及三明治装置用转移液浸泡后组装电转移装置。膜在正极,胶在负极。电压98U,2.5h。

  封闭硝酸纤维滤膜的蛋白质结合位点:取下膜,用TBS(100mM Tris-HCl(pH7.5),0.9%NaCl)洗2次/10min,加入40mL封闭液(本发明的“封闭液”,除非特别说明,都是指3g牛血清蛋白溶于100mL TBS),平放于旋转摇床,室温温育1h,以封闭滤膜的蛋白质结合位点。取出膜后用TBS洗2次/5min.TTBS(100mM Tris-HCl(pH 7.5),0.9%NaCl,0.1%Tween 20)洗2次/10min,TBS洗1次/10min

  硝酸纤维滤膜与第一抗体反应:加入一抗(按1:600稀释家兔抗血清,稀释剂为封闭液)。置于旋转摇床,室温温育1h。TTBS洗2次/10min,TBS洗1次/10min。

  硝酸纤维滤膜与第二抗体反应:将羊抗兔IgG按1:1500的比例用封闭液稀释。把硝酸纤维滤膜放入培养皿中,加入30ml二抗。室温振摇温育1h。TTBS室温振摇洗涤15min,共洗涤4次。

  硝酸纤维滤膜的显色反应:按NBT/BCIP染色试剂盒说明书,配制出碱性磷酸酶(AP)的显色底物溶液。黑暗处染色2-3min,ddH2O终止反应,干燥后拍照保存。结果见图4,从图4中可以看出,本发明提供的4种烟酰胺磷酸核糖转移酶与杜克嗜血杆菌nadV酶及天然nadV酶有相近的分子量,且在大肠杆菌中有更好的表达,为β-烟酰胺单核苷酸的生产提供了高效的生物合成基础。

  8.大肠杆菌发酵培养

  取含pET-Nam重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌液10mL,加入10L LB培养基中培养,摇床设为250rpm,温度37℃,加入抗生素,卡那霉素50μg/mL,检测OD600光度值记录大肠杆菌生长曲线。当OD600=0.5时加入0.5%NAM和1%乳糖,继续培养。

  取含pMal-Nam重组质粒的大肠杆菌TB1菌液1mL,加入1L LB培养基中培养,摇床设为250rpm,温度37℃,加入抗生素,氨苄霉素50μg/mL,检测OD600光度值记录大肠杆菌生长曲线。当OD600=0.55时加入0.2%NAM和0.5mM IPTG与0.5%葡萄糖,继续培养。

  取含pQE-Nam重组质粒的大肠杆菌M15菌液10mL,加入10L PYA培养基中培养,pH 8.0,摇床设为200rpm,温度37℃,加入抗生素,氨苄霉素amp 50μg/mL,检测OD600光度值记录大肠杆菌生长曲线。当OD600=0.4时加入0.5%NAM和1.0mM IPTG与0.5%葡萄糖,继续培养。

  取含pQE-Nam重组质粒的大肠杆菌M15菌液50mL,加入50L LB培养基中培养,摇床设为200rpm,温度37℃,加入抗生素,氨苄霉素amp 50μg/mL,检测OD600光度值记录大肠杆菌生长曲线。当OD600=0.45时加入1.0%NAM和1.5%乳糖,继续培养。

  9.NMN荧光分析

  培养4-12小时的菌液,通过离心机离心20min,收集上清和大肠杆菌细胞。大肠杆菌细胞用菌液同体积蒸馏水重新悬浮,利用超声波细胞破碎仪设置3次重复,破碎大肠杆菌细胞。荧光衍生分析参照现有方法。主要步骤是在96孔板上,加入大肠杆菌重悬液,即样本69μL,27.7μL含20%苯乙酮的二甲基亚砜和27.7μL 2mol/L氢氧化钾,冰上培育2min后,加入125μL 88%的甲酸;然后37℃,培育10min。在382nm波长激发光下,再用紫外线光度计测量445nm波长上的发射光。标准曲线的浓度范围0.0625×10-2~4×10-2与相关系数0.99通过标准品NMN(Sigma N3501-25MG)的8个标准稀释来获得。对照样本采用未被诱导的大肠杆菌菌液通过相同分析处理而得到。蛋白质浓度测定采用Bradford方法,使用牛血清白蛋白作为标准。NMN产量数据用毫克NMN每克蛋白质表示,即mg NMN per g of protein,其结果见表4。

  传统化学合成法目前一般只能实验室生产,生产的NMN每毫克(mg)成本在1.0-50.0元/mg;而本发明的发酵法,视生产规模的大小,每升(L)发酵液为单位的投入约5.0-20.0元/L;按每L最低约20mg的产率,获得的天然NMN成本为0.25-1.0元/mg,如果按照最高45mg/L的产量,在5.0元/L的成本下,则NMN成本仅约为0.1元/mg;从而可以看出,相对于传统方法,本发明的方法成本可以降低90%以上,经济效益显著。

  表4各Nampt酶重组载体在大肠杆菌发酵的NMN产量统计表

  以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

  序列表

  <110> 成都及禾生物科技有限公司

  <120> 用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶、编码基因、重组载体及应用

  <160> 8

  <170> SIPOSequenceListing 1.0

  <210> 1

  <211> 495

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <400> 1

  Met Asp Asn Leu Leu Asn Tyr Ser Ser Arg Ala Ser Ala Ile Pro Ser

  1 5 10 15

  Leu Leu Cys Asp Phe Tyr Lys Thr Ser His Arg Ile Gln Tyr Pro Glu

  20 25 30

  Gly Thr Gln Ile Leu Tyr Ser Thr Phe Thr Pro Arg Ser Asn Lys Gln

  35 40 45

  Ala Pro Tyr Leu Thr Arg Val Val Ser Phe Gly Phe Gln Ala Phe Ile

  50 55 60

  Thr Lys Tyr Leu Ile His Tyr Phe Asn Asp Asn Phe Phe Ser Arg Asp

  65 70 75 80

  Lys Asp Glu Val Val Ser Glu Tyr Ser Ala Phe Ile Lys Lys Thr Leu

  85 90 95

  Gln Leu Glu Asp Thr Gly Glu His Ile Ala Gln Leu His Glu Leu Gly

  100 105 110

  Tyr Leu Pro Ile Arg Ile Lys Ala Ile Pro Glu Gly Lys Ser Val Ala

  115 120 125

  Ile Lys Val Pro Val Met Thr Ile Glu Asn Thr His Pro Asp Phe Phe

  130 135 140

  Trp Leu Thr Asn Tyr Leu Glu Thr Leu Ile Asn Val Ser Leu Trp Gln

  145 150 155 160

  Pro Met Thr Ser Ala Ser Ile Ala Phe Ala Tyr Arg Thr Ile Leu Val

  165 170 175

  Lys Phe Ala Asn Glu Thr Cys Asp Asn Gln Asp His Val Pro Phe Gln

  180 185 190

  Ser His Asp Phe Ser Met Arg Gly Met Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu

  195 200 205

  Thr Ser Gly Ala Gly His Leu Thr Ser Phe Leu Gly Thr Asp Thr Ile

  210 215 220

  Pro Ala Ile Ser Phe Ile Glu Ala Tyr Tyr Gly Ser Lys Ser Leu Ile

  225 230 235 240

  Gly Thr Ser Ile Pro Ala Ser Glu His Ser Val Met Ser Ala His Gly

  245 250 255

  Val Asp Glu Leu Pro Thr Phe Arg Tyr Leu Met Ala Lys Tyr Pro His

  260 265 270

  Asn Met Leu Ser Ile Val Ser Asp Thr Thr Asp Phe Trp His Asn Ile

  275 280 285

  Thr Val Asn Leu Pro Leu Leu Lys Gln Glu Ile Met Ala Arg Pro Glu

  290 295 300

  Asn Ala Lys Val Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asp Phe Phe Ala Ile

  305 310 315 320

  Ile Cys Gly Asp Pro Thr Ala Asp Thr Glu His Glu Arg Lys Gly Leu

  325 330 335

  Ile Glu Cys Leu Trp Asp Ile Phe Gly Gly Thr Val Asn Gln Lys Gly

  340 345 350

  Tyr Lys Val Leu Asp Pro His Ile Gly Ala Ile Tyr Gly Asp Gly Val

  355 360 365

  Thr Tyr Glu Lys Met Phe Lys Ile Leu Glu Gly Leu Gln Ala Lys Gly

  370 375 380

  Phe Ala Ser Ser Asn Ile Val Phe Gly Val Gly Ala Gln Thr Tyr Gln

  385 390 395 400

  Arg Asn Thr Arg Asp Thr Leu Gly Phe Ala Ile Lys Ala Thr Ser Ile

  405 410 415

  Thr Ile Asn Gly Glu Glu Lys Ala Ile Phe Lys Asn Pro Lys Thr Asp

  420 425 430

  Asp Gly Leu Lys Lys Ser Gln Lys Gly Arg Val Lys Val Leu Ser Arg

  435 440 445

  Asp Thr Tyr Ile Asp Gly Leu Thr Ala Ala Asp Asp Phe Ser Asp Asp

  450 455 460

  Leu Leu Glu Val Val Phe Glu Asp Gly Lys Leu Val Arg Gln Thr Asp

  465 470 475 480

  Phe Asp Glu Ile Arg Gln Asn Leu Leu Val Ser Arg Thr Thr Leu

  485 490 495

  <210> 2

  <211> 488

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <400> 2

  Met Asp Ser Leu Leu Asn His Tyr Ser Arg Ala Ser Ala Ile Pro Ser

  1 5 10 15

  Leu Leu Cys Asp Phe Tyr Lys Thr Ser His Arg Ile Met Tyr Pro Glu

  20 25 30

  Gly Ser Gln Ile Ile Tyr Ser Thr Phe Thr Pro Arg Ser Asn Glu Gln

  35 40 45

  Ala Pro Tyr Leu Thr Gln Val Val Ser Phe Gly Phe Gln Ala Phe Ile

  50 55 60

  Ile Lys Tyr Leu Ile His Tyr Phe Asn Asp Asn Phe Phe Ser Arg Asp

  65 70 75 80

  Lys His Asp Val Val Thr Glu Tyr Ser Ala Phe Ile Glu Lys Thr Leu

  85 90 95

  Gln Leu Glu Asp Thr Gly Glu His Ile Ala Lys Leu His Glu Leu Gly

  100 105 110

  Tyr Leu Pro Ile Arg Ile Lys Ala Ile Pro Glu Gly Lys Thr Val Ala

  115 120 125

  Ile Lys Val Pro Val Met Thr Ile Glu Asn Thr His Pro Asp Phe Cys

  130 135 140

  Trp Leu Thr Asn Tyr Leu Glu Thr Leu Ile Asn Val Ser Leu Trp Gln

  145 150 155 160

  Pro Met Thr Ser Ala Ser Ile Ala Phe Ala Tyr Arg Thr Ala Leu Ile

  165 170 175

  Lys Phe Ala Asn Glu Thr Cys Asp Asn Gln Glu His Val Pro Phe Gln

  180 185 190

  Ser His Asp Phe Ser Met Arg Gly Met Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu

  195 200 205

  Thr Ser Gly Ala Gly His Leu Thr Ser Phe Leu Gly Thr Asp Thr Ile

  210 215 220

  Pro Ala Leu Ser Phe Val Glu Ala Tyr Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Ile

  225 230 235 240

  Gly Thr Ser Ile Pro Ala Ser Glu His Ser Val Met Ser Ser His Gly

  245 250 255

  Val Asp Glu Leu Ser Thr Phe Arg Tyr Leu Met Ala Lys Phe Pro Asn

  260 265 270

  Ser Met Leu Ser Ile Val Ser Asp Thr Thr Asp Phe Trp His Asn Ile

  275 280 285

  Thr Val Asn Leu Pro Leu Leu Lys Gln Glu Ile Ile Ala Arg Pro Glu

  290 295 300

  Asn Ala Arg Leu Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asn Phe Phe Ala Ile

  305 310 315 320

  Ile Cys Gly Asp Pro Thr Ala Asp Thr Glu His Glu Arg Lys Gly Leu

  325 330 335

  Ile Glu Cys Leu Trp Asp Ile Phe Gly Gly Thr Val Asn Gln Lys Gly

  340 345 350

  Tyr Lys Val Ile Asn Pro His Ile Gly Ala Ile Tyr Gly Asp Gly Val

  355 360 365

  Thr Tyr Glu Lys Met Val Lys Ile Leu Glu Gly Leu Lys Ala Lys Gly

  370 375 380

  Phe Ala Ser Ser Asn Ile Val Phe Gly Val Gly Ala Gln Thr Tyr Gln

  385 390 395 400

  Arg Asn Thr Arg Asp Thr Leu Gly Phe Ala Leu Lys Ala Thr Ser Ile

  405 410 415

  Thr Ile Asn Gly Glu Glu Lys Ala Ile Phe Lys Asn Pro Lys Thr Asp

  420 425 430

  Asn Gly Leu Lys Lys Ser Gln Lys Gly Arg Val Lys Leu Leu Ser Tyr

  435 440 445

  Asp Thr Tyr Leu Asp Gly Leu Thr Ala Lys Asp Asp Phe Ser Asp Asp

  450 455 460

  Leu Leu Glu Leu Leu Phe Glu Asn Gly Lys Leu Leu Arg Arg Thr Asp

  465 470 475 480

  Phe Asp Gln Ile Arg Gln Asn Leu

  485

  <210> 3

  <211> 490

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <400> 3

  Met Tyr Met Asn Pro Leu Leu Leu Thr Asp Gly Tyr Lys Val Asp His

  1 5 10 15

  Arg Arg Gln Tyr Pro Asp Asn Thr Thr Leu Val Tyr Ser Asn Trp Thr

  20 25 30

  Pro Arg Lys Ser Arg Ile Glu Tyr Val Asp Gln Met Val Phe Phe Gly

  35 40 45

  Leu Gln Tyr Phe Ile Lys Lys Tyr Ile Ile Glu Asp Phe Asn Arg Asn

  50 55 60

  Phe Phe Asn Gln Pro Lys Glu Gln Val Ile Lys Lys Tyr Ala Arg Arg

  65 70 75 80

  Ile Asn Asn Tyr Leu Gly Pro Asn Asn Val Gly Thr Gln His Ile Glu

  85 90 95

  Asp Leu His Asp Leu Gly Tyr Leu Pro Met Val Ile Lys Ala Leu Pro

  100 105 110

  Glu Gly Ser Val Tyr Pro Leu Arg Val Pro Met Phe Thr Met Tyr Asn

  115 120 125

  Thr Asp Glu Arg Phe Phe Trp Leu Thr Asn Tyr Phe Glu Thr Leu Leu

  130 135 140

  Ser Ala Val Val Trp Leu Pro Cys Thr Ser Ala Thr Ile Ala Lys Gln

  145 150 155 160

  Tyr Arg Lys Ile Leu Glu Thr Tyr Ala Leu Glu Thr Ser Ser Asp Ile

  165 170 175

  Ala Phe Val Asp Trp Gln Gly His Asp Phe Ser Met Arg Gly Met Gly

  180 185 190

  Gly Ile Glu Ala Ala Val Met Ser Gly Ala Gly His Leu Leu Ser Phe

  195 200 205

  Thr Gly Thr Asp Thr Ile Pro Ala Ile Asp Phe Leu Glu Gln Tyr Tyr

  210 215 220

  Asn Ala Asp Ser Asp Lys Glu Leu Val Gly Gly Ser Val Ala Ala Thr

  225 230 235 240

  Glu His Ser Val Met Cys Met Gly Gly Met Glu Gly Glu Leu Glu Thr

  245 250 255

  Phe Lys Arg Leu Ile Glu Asp Ile Tyr Pro Ser Gly Ile Val Ser Ile

  260 265 270

  Val Ser Asp Thr Trp Asp Leu Trp Lys Val Leu Thr Glu Tyr Leu Pro

  275 280 285

  Ala Leu Lys Glu Arg Ile Leu Ala Arg Asp Gly Lys Val Val Ile Arg

  290 295 300

  Pro Asp Ser Gly Asp Pro Val Lys Ile Ile Cys Gly Asn Pro Asn Gly

  305 310 315 320

  Lys Ile Gly Ser Pro Glu Tyr Lys Gly Val Ile Glu Leu Leu Trp Asp

  325 330 335

  Val Phe Gly Gly Thr Thr Asn Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Leu Asp Pro

  340 345 350

  His Ile Gly Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Ile Thr Ile Glu Arg Ala Glu

  355 360 365

  Ala Ile Cys Glu Arg Leu Lys Ala Lys Gly Phe Ala Ser Thr Asn Val

  370 375 380

  Val Leu Gly Ile Gly Ser Phe Thr Tyr Gln Tyr Asn Thr Arg Asp Thr

  385 390 395 400

  Phe Gly Phe Ala Met Lys Ala Thr Tyr Gly Glu Val Asp Gly Glu Gly

  405 410 415

  Arg Glu Ile Phe Lys Asp Pro Ile Thr Asp Asp Gly Thr Lys Lys Ser

  420 425 430

  Ala Lys Gly Leu Val Ala Val Phe Lys Asp Glu Gln Gly Gln Phe Tyr

  435 440 445

  Leu Lys Asp Gln Ala Ser Trp Gln Asp Val Asn Asn Cys Glu Phe Val

  450 455 460

  Pro Val Phe Ala Asp Gly Glu Leu Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Ala Asp

  465 470 475 480

  Ile Arg Ala Arg Leu Ala Ala Ser Arg Arg

  485 490

  <210> 4

  <211> 485

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <400> 4

  Met Tyr Leu Asn Pro Val Thr Ala Ile Asp Gly Tyr Lys Val Asp His

  1 5 10 15

  Arg Arg Gln Tyr Pro Asp Asn Thr Gln Val Ile Phe Ser Asn Leu Thr

  20 25 30

  Ala Arg Lys Ser Arg Arg Gly Tyr Thr Asp Gln Met Val Phe Phe Gly

  35 40 45

  Leu Gln Tyr Phe Ile Lys His Tyr Leu Ile Asp Ser Trp Asn Arg Asp

  50 55 60

  Phe Phe Gln Gln Pro Lys Glu Gln Val Ile Cys Gln Phe Ser Arg Arg

  65 70 75 80

  Ile Asn Asn Tyr Leu Gly Pro Asn Asn Val Gly Thr Gln His Ile Glu

  85 90 95

  Glu Leu His Asp Leu Gly Tyr Leu Pro Ile Lys Ile Met Ala Leu Pro

  100 105 110

  Glu Gly Ser Val Tyr Pro Leu Lys Val Pro Cys Leu Ile Leu Tyr Asn

  115 120 125

  Thr Asp Glu Arg Phe Phe Trp Leu Thr Asn Tyr Leu Glu Thr Ile Leu

  130 135 140

  Ser Ala Asn Val Trp Gly Met Cys Thr Ser Ala Thr Thr Ala Leu Gln

  145 150 155 160

  Tyr Arg Lys Ile Phe Glu Ala Tyr Ala Leu Glu Thr Asp Gly Asp Ile

  165 170 175

  Ala Phe Val Asp Trp Gln Gly His Asp Phe Ser Phe Arg Gly Met Tyr

  180 185 190

  Gly Val Glu Ala Ala Ile Met Ser Gly Ala Ala His Leu Leu Ser Phe

  195 200 205

  Thr Gly Thr Asp Thr Ile Pro Ala Ile Asp Phe Leu Glu Gln Tyr Tyr

  210 215 220

  Asn Ala Asp Ser Asp Lys Glu Leu Val Gly Gly Ser Val Ala Ala Thr

  225 230 235 240

  Glu His Ser Val Met Cys Met Gly Gly Met Glu Gly Glu Leu Glu Thr

  245 250 255

  Phe Lys Arg Leu Ile Glu Asp Ile Tyr Pro Ser Gly Ile Val Ser Ile

  260 265 270

  Val Ser Asp Thr Trp Asp Leu Trp Lys Val Leu Thr Glu Tyr Leu Pro

  275 280 285

  Ala Leu Lys Glu Arg Ile Leu Ala Arg Asp Gly Lys Val Val Phe Arg

  290 295 300

  Pro Asp Thr Gly Cys Pro Val Lys Ile Ile Cys Gly Asp Pro Gln Ala

  305 310 315 320

  Pro Ile Gly Ser Pro Glu Tyr Lys Gly Ala Ile Glu Cys Leu Trp Asp

  325 330 335

  Val Phe Gly Gly Ser Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Lys Leu Leu Asp Ser

  340 345 350

  His Val Gly Leu Ile Tyr Gly Asp Ser Ile Thr Ile Glu Arg Ala Glu

  355 360 365

  Ala Ile Cys Ala Gly Leu Lys Ala Lys Gly Phe Ala Ser Thr Asn Ile

  370 375 380

  Val Phe Gly Ile Gly Ser Phe Thr Tyr Gln His Val Thr Arg Asp Thr

  385 390 395 400

  Asp Gly Tyr Ala Val Lys Ala Thr Phe Ala Lys Val Asp Gly Lys Asp

  405 410 415

  Arg Glu Ile Phe Lys Asp Pro Lys Thr Asp Asp Gly Thr Lys Lys Ser

  420 425 430

  Ala Lys Gly Leu Val Ala Val Phe Lys Asp Glu Gln Gly Gln Phe Tyr

  435 440 445

  Leu Lys Asp Gln Ala Ser Trp Gln Asp Val Asn Asn Cys Glu Phe Val

  450 455 460

  Pro Val Phe Ala Asp Gly Lys Leu Leu Asn Glu Val Ser Leu Thr Glu

  465 470 475 480

  Ile Arg Ala Arg Leu

  485

  <210> 5

  <211> 1488

  <212> DNA

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <400> 5

  atggataacc tgttaaatta tagtagtcgt gctagtgcta ttccatcatt attatgcgat 60

  ttttacaaaa catctcatcg tatccagtat ccggaaggta cacaaattct gtatagtaca 120

  tttacacctc gtagcaataa acaagcgcct tatttaacac gtgttgtgtc atttggtttt 180

  caagccttta tcaccaaata tttaattcat tattttaatg ataacttttt ttctcgtgat 240

  aaagatgaag ttgtgagcga atactctgca tttattaaga aaaccttaca gttagaggat 300

  acgggtgaac acattgcaca gttacatgag ttgggttatt tgcctatccg tattaaagct 360

  attcctgaag gaaaaagcgt ggcaattaaa gttccggtga tgacgattga aaatacgcat 420

  cctgatttct tttggctgac taactattta gaaacattaa ttaatgtatc actgtggcag 480

  ccgatgactt ctgcctcgat tgcttttgct tatcgtacaa ttttagttaa atttgctaat 540

  gaaacttgtg ataatcaaga tcatgtgcca tttcaatcgc atgatttttc aatgcgtggt 600

  atgagttctt tagaatccgc agaaacttca ggtgctggcc atttaacttc ttttttaggt 660

  acagacacta ttcctgcaat ttcttttatt gaagcgtatt atggttcaaa gagtctgatt 720

  ggcacgtcta ttccggcttc tgagcattca gtaatgagtg cacatggtgt cgatgaatta 780

  ccgacatttc gttatttaat ggcaaaatat ccgcataata tgttgtcaat tgtgtcagat 840

  actacagact tttggcataa cattaccgtt aatttgccgt tattaaagca agaaattatg 900

  gcacgtccag aaaatgccaa agttgtcatt cgtccagata gcggtgactt ttttgcgatt 960

  atttgtggtg atccaaccgc tgatactgag catgaacgta aaggactgat tgaatgttta 1020

  tgggatattt ttggtggtac agttaatcag aaaggttata aagtgttaga tccacatatt 1080

  ggggcaattt atggtgatgg cgtgacttat gaaaaaatgt ttaagatctt agaaggatta 1140

  caagccaaag gatttgcctc aagtaatatt gtgtttggcg ttggtgcaca aacctatcaa 1200

  cgtaatacac gtgatacgtt gggctttgcg attaaagcga catctatcac tattaatggc 1260

  gaagaaaaag ctattttcaa aaatcctaaa accgatgatg gtctgaaaaa atcgcaaaaa 1320

  ggtcgtgtta aagtgctgtc tcgtgatact tacattgatg gtttaactgc agcggatgat 1380

  tttagtgatg atttattaga ggtggttttt gaagatggta agttagttcg ccaaacagac 1440

  tttgatgaaa ttcgtcaaaa cttgttagtt agtcgcacta cgctgtaa 1488

  <210> 6

  <211> 1467

  <212> DNA

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <400> 6

  atggatagcc tgttaaatca ttatagtcgt gctagtgcta ttccatcatt attatgcgat 60

  ttttacaaaa catctcatcg tatcatgtat ccggaaggtt cacaaattat ttatagtaca 120

  tttacacctc gtagcaatga acaagcgcct tatttaacac aagttgtgtc atttggtttt 180

  caagccttta tcattaaata tttaattcat tattttaatg ataacttttt ttctcgtgat 240

  aaacatgatg ttgtgactga atactctgca tttattgaga aaaccttaca gttagaggat 300

  acgggtgaac acattgcaaa attacatgag ttgggttatt tgcctatccg tattaaagct 360

  attcctgaag gaaaaacggt ggcaattaaa gttccggtga tgacgattga aaatacgcat 420

  ccggatttct gttggctgac taactattta gaaacattaa ttaatgtatc actgtggcag 480

  ccgatgactt ctgcctcgat tgcttttgct tatcgtacag cattaattaa atttgctaat 540

  gaaacttgtg ataatcaaga acatgtgcca tttcaatcgc atgatttttc aatgcgtggt 600

  atgagttctt tagaatccgc agaaacttca ggtgctggcc atttaacttc ttttttaggt 660

  acagacacta ttcctgcact gtcttttgtt gaagcgtatt atggttcaag cagtctgatt 720

  ggcacgtcta ttccggcttc tgagcattca gtaatgagtt cacatggtgt cgatgaatta 780

  tcaacatttc gttatttaat ggcaaaattt ccgaatagta tgttgtcaat tgtgtcagat 840

  actacagact tttggcataa cattaccgtt aatttgccgt tattaaagca agaaattatt 900

  gcacgtccag aaaatgcccg tttagtcatt cgtccagata gcggtaactt ttttgcgatt 960

  atttgtggtg atccaaccgc tgatactgag catgaacgta aaggactgat tgaatgttta 1020

  tgggatattt ttggtggtac agttaatcag aaaggttata aagtgatcaa tccacatatt 1080

  ggggcaattt atggtgatgg cgtgacttat gaaaaaatgg ttaagatctt agaaggatta 1140

  aaagccaaag gatttgcctc aagtaatatt gtgtttggcg ttggtgcaca aacctatcaa 1200

  cgtaatacac gtgatacgtt gggctttgcg ctgaaagcga catctatcac tattaatggc 1260

  gaagaaaaag ctattttcaa aaatcctaaa accgataatg gtctgaaaaa atcgcaaaaa 1320

  ggtcgtgtta aactgctgtc ttatgatact taccttgatg gtttaactgc aaaggatgat 1380

  tttagtgatg atttattaga gctgttattt gaaaatggta agttattacg ccgtacagac 1440

  tttgatcaga ttcgtcaaaa cttgtaa 1467

  <210> 7

  <211> 1473

  <212> DNA

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <400> 7

  atgtacatga atccgctgct gctgaccgat ggctacaaag tcgaccaccg tcgtcaatat 60

  ccggataata ctacactggt ttatagtaac tggaccccgc gtaaatcccg tattgaatat 120

  gttgaccaaa tggtattttt tggcttgcag tattttatca agaaatacat tattgaagat 180

  tttaaccgta atttctttaa tcagccgaaa gagcaagtga tcaagaaata tgcccgccgc 240

  attaataact atctgggacc gaataatgtc ggcactcagc atattgagga cttgcatgat 300

  ttaggctatt taccaatggt tatcaaggca ttgcctgaag gctcagtata tccattacgt 360

  gtgcctatgt ttaccatgta caataccgat gagcgcttct tttggctgac caattatttt 420

  gaaaccctgc tgtccgctgt tgtgtggctt ccgtgtacta gtgctactat tgcgaaacaa 480

  taccgcaaaa tcttagagac ctatgcgtta gaaaccagca gtgacatcgc ttttgttgat 540

  tggcagggtc acgattttag tatgcgtggc atgggtggta ttgaggccgc ggtcatgagc 600

  ggcgccggtc atttactgag ttttactggg acagatacca ttccggccat tgattttctg 660

  gagcaatatt acaatgctga tagtgataaa gaactggtcg gtggcagtgt ggctgcaacg 720

  gagcacagcg tgatgtgcat gggtggcatg gagggtgaat tagagacgtt caaacgtctg 780

  attgaagata tttaccctag tggcattgtg agtatcgttt ctgatacatg ggatctgtgg 840

  aaggtgctga cagaatatct gccagcgtta aaagaacgca ttctggcccg cgatggcaaa 900

  gtggtgattc gtcctgatag cggtgatcct gtgaagatca tttgtggcaa tccaaatggt 960

  aaaatcggta gccctgagta taaaggcgtt atcgagctgt tgtgggatgt ctttggtggc 1020

  accacaaatg ccaaaggtta caaagaatta gatccgcata tcggagcaat ttatggcgat 1080

  tcaattacga ttgaacgtgc tgaagccatt tgtgaacgtt tgaaggccaa aggttttgca 1140

  tcaaccaatg ttgtgcttgg aattggcagt tttacctatc aatacaatac ccgtgatact 1200

  ttcggttttg ccatgaaagc gacctatggt gaagttgatg gtgaaggtcg tgaaatcttt 1260

  aaagatccta ttactgatga tggcactaaa aaatccgcta agggtttagt agcggtattt 1320

  aaagatgagc agggtcaatt ttatctgaaa gatcaagcca gctggcaaga tgttaacaat 1380

  tgcgagtttg tcccggtatt tgccgatggt gaattattaa cggaatattc tttggctgat 1440

  attcgcgcac gtctggcagc gtctcgtcgc taa 1473

  <210> 8

  <211> 1458

  <212> DNA

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <400> 8

  atgtacttga atccggttac tgctattgat ggctacaaag tcgaccaccg tcgtcaatat 60

  ccggataata ctcaagtgat ttttagtaac ttgaccgccc gtaaatcccg tcgtggttat 120

  acagaccaaa tggtattttt tggcttgcag tattttatca agcattactt aattgacagt 180

  tggaaccgtg atttctttca acagccgaaa gagcaagtga tctgccaatt ctcccgccgc 240

  attaataact atctgggacc gaataatgtc ggcactcagc atattgagga gttgcatgat 300

  ttaggctatt taccaattaa aatcatggca ttgcctgaag gctcagtata tccattaaaa 360

  gtgccttgct tgattttgta caataccgat gagcgcttct tttggctgac caattatctg 420

  gaaaccatcc tgtccgctaa tgtgtggggt atgtgtacta gtgctactac cgcgctgcaa 480

  taccgcaaaa tctttgaggc ttatgcgtta gaaaccgatg gtgacatcgc ttttgttgat 540

  tggcagggtc acgattttag tttccgtggc atgtatggtg tagaggccgc gatcatgagc 600

  ggcgccgccc atttactgag ttttactggg acagatacca ttccggccat tgattttctg 660

  gagcaatatt acaatgctga tagtgataaa gaactggtcg gtggcagtgt ggcagcaacg 720

  gagcacagcg tgatgtgcat gggtggcatg gagggtgaat tagagacgtt caaacgtctg 780

  attgaagata tttaccctag cggcattgtg agtatcgttt ctgatacctg ggatctgtgg 840

  aaagtgctga cagaatatct gccggcgtta aaagaacgca ttctggcccg cgatggcaaa 900

  gtggtgtttc gtcctgatac gggttgccct gtgaagatca tttgtggcga tccacaagca 960

  ccaatcggta gccctgagta taaaggcgct atcgagtgtt tgtgggatgt ctttggtggc 1020

  agcacaactg ccaaaggtta caaattactg gatagccatg tcggactgat ttatggcgat 1080

  tcaattacga ttgaacgtgc tgaagccatt tgtgccggtt tgaaggccaa aggttttgca 1140

  tcaaccaata ttgtgtttgg aattggcagt tttacctatc aacacgtgac ccgtgatact 1200

  gacggttatg ccgtgaaagc gacctttgcg aaagttgatg gtaaagaccg tgaaatcttt 1260

  aaagatccta aaactgatga tggcactaaa aaatccgcta agggtttagt agcggtattt 1320

  aaagatgagc agggtcaatt ttatctgaaa gatcaagcca gctggcaaga tgttaacaat 1380

  tgcgagtttg tcccggtatt tgccgatggt aaattattaa atgaagtttc tttgaccgaa 1440

  attcgcgcac gtctgtaa 1458